Лекарственный справочник гэотар. Анемии, связанные с нарушением синтеза порфиринов
В.В.Долгов, С.А.Луговская,
В.Т.Морозова, М.Е.Почтарь
Российская медицинская академия
последипломного образования
Анемии, связанные с нарушением синтеза порфиринов относится к группе анемий, обусловленных недостаточностью эритропоэза.
Анемии этой группы обусловлены недостаточной или аномальной утилизацией внутриклеточного железа при синтезе гемоглобина, несмотря на нормальное или даже повышенное содержание железа в митохондриях эритрокариоцитов. Такие дефекты могут быть связаны с наследственными нарушениями, главным образом при синтезе порфиринов или с приобретенным характером поражения, например, в результате отравления свинцом или недостаточности витамина В 6 . Отличительным признаком этого типа анемий является насыщение организма железом, в связи с чем ранее использовался термин "сидероахрестические", т. е. железонасыщенные анемии.
Обмен порфиринов
Порфирины используются при синтезе гема. Они синтезируются во всех клетках организма, но основная масса - в ядерных клетках эритроидного ростка костного мозга. Гем также синтезируется в мышцах для образования миоглобина, который связывает кислород и выполняет роль дополнительного его источника при гипоксии. Синтез порфиринов происходит и в клетках печени, он необходим для образования каталазы, пероксидазы, цитохромов, участвующих в электронном транспорте при энергообразовании в клетках. Печень - орган с наиболее выраженной гем-продуцирующей функцией. Гем - это тетрапирроловое ядро (протопорфирин), содержащее железо (рис. 25).
Гем одинаков для всех видов гемоглобина, последние различаются между собой структурой глобина. Гем крайне неустойчив и легко превращается в гематин с окислением Fе +2 в Fе +3 и присоединением к последнему ОН — . Он также легко превращается в гемин, который вместо ОН — содержит хлор. Гем обладает способностью вступать в обратимую комбинацию с кислородом. При связывании кислорода железо должно быть в активной двухвалентной форме. Основные этапы синтеза тема показаны на рис. 26. Каждый этап контролируется специфическим ферментом.
Начинается синтез тема в митохондриях с присоединения сукцинил-кофермента-А (СоА) к глицину, в результате чего образуется δ-аминолевулиновая кислота (АЛК). Этот процесс идет с участием фермента АЛК-синтетазы, в качестве кофермента которого выступает пиридоксаль-5-фосфат (производное витамина В 6). Активность фермента может быть угнетена химическими веществами, в частности свинцом, алкоголем, снижена глюкозой или гемом. Считается, что АЛК-ситетаза ограничивает скорость биосинтеза тема в печени. При конденсации двух молекул 5-АЛК образуется порфобилиноген (ПБГ). Эта реакция катализируется дегидразой АЛК, активность которой снижается под действием свинца и гемина. При конденсации четырех молекул ПБГ синтезируется уропорфириноген (УРО). В этом процессе участвуют 2 фермента: уропорфириноген-III-синтетаза и порфобилиноген-дезаминаза. Из УРО образуется копропорфириноген III, синтез которого катализируется ферментом УРО-декарбоксилазой. Копропорфириноген III под действием копропорфириноген-III-оксидазы превращается в протопорфириноген IX. Следующий этап биосинтеза тема - преобразование протопорфириногена IX в протопорфирин IX - осуществляется ферментом протопорфириногеноксидазой. Заканчивается синтез порфиринов включением двухвалентного железа в протопорфирин IX. Процесс катализируется митохондриальным ферментом феррохелатазой (гемсинтетаза), в результате чего образуется гем. Цепь реакций синтеза порфиринов регулируется механизмом обратной связи, где конечный продукт гем регулирует синтез АЛК на уровне транскрипции и трансляции в клетках печени. Биосинтез порфиринов осуществляется в эритрокариоцитах костного мозга и гепатоцитах. Основная часть порфиринов, синтезированных в костном мозге, идет для образования гемоглобина.
В результате дефицита одного из ферментов синтеза тема развивается порфирия. При порфирии из-за нарушения синтеза тема снимается механизм обратной связи, прекращается ингибирование скорость-лимитирующего фермента АЛК-синтетазы, поэтому при легких формах порфии удается поддерживать адекватный синтез тема (анемия не развивается), а происходит накопление промежуточных продуктов.
АЛК, ПБГ и уропорфириноген - водорастворимы, поэтому при накоплении экскретируются с мочой (рис. 27), при этом моча приобретает темно-красный оттенок. Копропорфирин и протопорфирин не растворимы в воде, они экскретируются с желчью и определяются в кале.
Синтез порфиринов происходит в виде двух изомеров III и I. III изомер порфиринов используется для синтеза тема. При нарушении этого пути изомер I синтезируется в большем количестве, чем в норме. Эритроциты, содержащие гемоглобин с изомером I, имеют меньшую продолжительность жизни и быстро разрушаются в селезенке (болезнь Гюнтера или врожденная эритропоэтическая порфирия).
Анемии при нарушениях обмена порфиринов
Развитие анемии обусловлено недостаточной или аномальной утилизацией внутриклеточного железа при синтезе гемоглобина, несмотря на нормальное или даже повышенное содержание железа в митохондриях эритроидных предшественников.
Лабораторные исследования выявляют высокую концентрацию железа и ферритина в сыворотке крови и повышенное насыщение трансферрина железом. В костном мозге отмечается гиперплазия эритроидных клеток. Окраска на железо выявляет патогномоничные изменения, обусловленные накоплением неутилизированного железа в митохондриях эритрокариоцитов - кольцевидные сидеробласты.
Наследственные и приобретенные анемии, связанные с нарушением синтеза порфиринов, характеризуются гипохромией, высоким содержанием железа сыворотки и гемосидерозом органов.
Наследственные анемии этого типа встречаются сравнительно редко, преимущественно у мужчин, так как наследование сцеплено с Х-хромосомой. Относительно чаще наблюдается форма болезни, вызванная дефектами синтеза δ-аминолевулиновой кислоты. Нарушение образования протопорфирина обуславливает невозможность связывания железа и вследствие этого происходит накопление его в организме. Преимущественное поступление железа в печень приводит к развитию цирроза, в поджелудочную железу - к сахарному диабету, накопление железа в яичках - к евнухоидизму, в надпочечниках - надпочечниковой недостаточности. Клинические проявления болезни зависят от выраженности анемии и признаков избыточного отложения железа в организме. У больных в молодом возрасте анемия в большинстве случаев невыраженная (80-90 г/л), однако гемоглобин постепенно падает до 50-60 г/л. Содержание ретикулоцитов нормальное или несколько сниженное. Эритроциты гипохромные, отмечается анизоцитоз, пойкилоцитоз, отдельные мишеневидные эритроциты.
В костном мозге - гиперплазия красного ростка, увеличен процент базофильных, полихроматофильных и снижено количество оксифильных эритрокариоцитов, много кольцевидных сидеробластов (рис. 28). Для этой анемии характерны признаки неэффективного эритропоэза, который определяется как анемия с относительной или абсолютной ретикулоцитопенией.
Содержание железа в сыворотке значительно повышено (до 100 мкмоль/л), трансферрин насыщен железом почти на 100%. При исследовании содержания порфиринов в эритроцитах у некоторых больных обнаруживается снижение протопорфирина до 3-9 мкмоль/л (норма 18-90 мкмоль/л) и повышение копропорфирина до 60-75 мкмоль/л (норма до 12 мкмоль/л). В отдельных случаях снижается как протопорфирин, так и копропорфирин. Содержание δ-аминолевулиновой кислоты и копропорфирина в моче нормальное.
Приобретенные анемии обусловлены нарушением синтеза порфиринов, возникающие чаще при отравлении свинцом или дефиците витамина В 6 .
Патогенез анемии при свинцовом отравлении . Свинец блокирует активные центры двух ферментов, участвующих в синтезе гема - синтетазы δ-аминолевулиновой кислоты и феррохелатазы, снижает скорость синтеза α-цепи глобина. Нарушается включение железа в молекулу протопорфирина, увеличивается содержание железа в сыворотке и отложение его в тканях. Своеобразен вид больного - землистая бледность с сероватым оттенком, связанная как с анемией, так и со спазмом сосудов и отложением в коже порфиринов, может быть лиловая кайма на деснах.
В костном мозге отмечается резкое увеличение кольцевидных сидеробластов (рис. 28). В периферической крови постепенно снижается содержание гемоглобина до 50-60 г/л, эритроциты с выраженной гипохромией (низкие цветовой показатель, МСН, МСНС), выявляется анизо-пойкилоцитоз, появляется базофильная пунктация эритроцитов (рис. 29).
Содержание железа в сыворотке крови повышается до 350-550 мкг/дл, насыщение трансферрина железом достигает 100%. В сыворотке крови отмечается высокая концентрация ферритина. Самым характерным биохимическим признаком свинцового отравления является увеличение концентрация в моче δ-аминолевулиновой кислоты и копропорфирина, в эритроцитах повышено содержание протопорфирина.
Poly(L-histidine)-tagged 5-aminolevulinic acid prodrugs: new photosensitizing precursors of protoporphyrin IX for photodynamic colon cancer therapy
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367496/
5-Аминолевулиновая кислота (ALA) и ее производные широко использовались в фотодинамической терапии. Основной недостаток, связанный с диагнозом ФЛ (ALA-PDT) и ALA-флуоресценцией, связан с гидрофильной природой ALA и отсутствием селективности в отношении опухолевых и непухотных клеток. Применение определенных триггеров, таких как рН, в обычные сенсибилизаторы для контролируемого высвобождения 1O2 является многообещающей стратегией для лечения опухолей.
Ряд рН-чувствительных ALA-поли (L-гистидиновых) пролекарств синтезировали путем полимеризации с раскрытием кольца 1-бензил-N-карбокси-L-гистидинового ангидрида, инициированного группой гидрохлорида амина ALA. В качестве альтернативы ALA для PDT синтезированные пролекарства использовались для лечения клеточной линии HCT116 культивируемого рака толстой кишки человека при различных условиях рН. Влияние производных ALA-p (L-His) n оценивали, контролируя интенсивность флуоресценции протопорфирина IX и измеряя выживаемость клеток после соответствующего светового облучения.
Цитотоксичность и темная токсичность ALA и синтезированных ALA-p (L-His) производных в клетках HEK293T и HCT116 в отсутствие света при рН 7,4 и 6,8 показывают, что жизнеспособность клеток была относительно выше 100%. ALA-p (L-His) n демонстрирует высокую фототоксичность и селективность в разных условиях pH по сравнению с ALA. Поскольку длина цепи гистидина возрастает в пролекарствах ALA-p (L-His) n, эффект ФДТ оказался более мощным. В частности, высокая фототоксичность наблюдалась, когда клетки обрабатывали ALA-p (L-His) 15, по сравнению с лечением с использованием только ALA.
Недавно синтезированные производные ALA-p (L-His) n являются эффективной альтернативой ALA для усиления образования протопорфирина IX и селективности фототоксического эффекта в опухолевых клетках.
Фотодинамическая терапия (ФДТ) с использованием 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) приобретает все большее внимание в медицине как важный и эффективный метод лечения различных опухолевых поражений и предраковых расстройств.1 В последние годы флуоресцентное фотообнаружение внимание как новый подход к селективному выявлению и лечению рака. Одним из основных механизмов является производство фотосенсибилизатора, протопорфирина IX (PpIX), из предшественника, ALA. Внешнее добавление ALA или его производных приводит к усиленному синтезу порфирина клетками. Джеймс и Потье впервые описали подход in situ к превращению ALA, нефотоактивного предшественника, в PpIX, естественно происходящий в результате фотосенсибилизирующих видов, через биосинтетический путь клеточного гема.2 В клиническом применении, когда генерируются достаточные внутриклеточные уровни PpIX, целенаправленная ткань облучается светом подходящей длины волны для активации сенсибилизатора и инициирует цепочку событий, которые в конечном итоге приводят к гибели клеток. На молекулярном уровне это связано с взаимодействием возбужденного фотосенсибилизатора с молекулярным кислородом, приводящим к образованию электрофильных видов (синглетного кислорода и / или радикалов), которые вызывают окислительное повреждение клеточных компонентов, таких как фосфолипидные мембраны, нуклеиновые кислоты и белки.3
PpIX, генерируемый экзогенным АЛА, имеет несколько преимуществ по сравнению с другими типами фотосенсибилизаторов, такими как синтетические порфириновые или фталоцианиновые производные, которые были применены в PDT. Например, риск чрезмерной обработки ALA-PDT ограничен из-за быстрого клиренса ALA из организма, в то время как насыщение продукции PpIX при высоких дозах ALA также предотвращает чрезмерное образование PpIX в тканях.4 Относительно быстрое фотообесцвечивание PpIX также означает, что фототоксические эффекты ALA-PDT не являются стойкими.5 Главный недостаток, связанный с диагнозом флуоресценции ALA-PDT и ALA, обусловлен гидрофильной природой самой ALA. При физиологическом рН ALA представляет собой ион цвиттера; это замедляет его способность преодолевать биологические барьеры, такие как клеточные мембраны, что приводит к неоднородному распределению в целевой ткани. Селективность ФДТ является важным фактором, поскольку нормальные клетки также способны накапливать сенсибилизаторы, что приводит к длительной фотосенсибилизации кожи. Таким образом, необходимо улучшить селективность фотосенсибилизаторов для опухолевых и нетканых клеток.
Чтобы преодолеть эту трудность, было предпринято несколько химических подходов к улучшению включения и селективности ALA. Один из подходов заключался в использовании большего количества липофильных ALA-производных, таких как алкиловые или этиленгликолевые эфиры, которые являются потенциальными субстратами для клеточных эстераз, 6-9 или разных систем доставки, включая дендримеры 10-12 и липосомы.13,14. Использование алкиловых эфиров из ALA приводит к неспецифическому распределению ALA во всех типах клеток, но с увеличением продуцирования PpIX в опухолевых клетках.15 Другой подход к получению пролекарств ALA, которые обладают как улучшенными физико-химическими свойствами, так и может селективно высвобождать ALA в определенных клеточных линиях, заключается в том, чтобы включить ALA в короткий пептидные производные. Они стабильны при физиологическом рН, в отличие от ALA и его сложных эфиров. В этой связи Casas et al. 16 и Berger et al. 17 показали, что включение ALA в короткое пептидное производное обеспечит подходящее средство облегчения как трансдермальной доставки, так и улучшенной селективности в отношении раковых клеток, представляя потенциальные субстраты для поверхности клеток и цитоплазматических пептидаз и / или лиганды для пептидных и аминокислотных транспортеров. Следуя этому подходу, Ludovic et al18 и Giuntini et al. 19 также показали, что включение ALA в короткие производные пептидов является эффективным общим подходом для увеличения клеточной доставки ALA.
Особый интерес представляет применение определенных признаков, таких как рН или биоаффинность, в обычные сенсибилизаторы для контролируемого высвобождения 1O2. Селективность сенсибилизатора, который продуцирует 1O2 при кислотном рН, но почти дезактивируется при физиологическом рН, была бы полезна при лечении рака, потому что рН в растущих злокачественных опухолях имеет тенденцию быть несколько ниже, чем у окружающей нормальной ткани. Совсем недавно Чжу и др. Показали, что модифицированный имидазолом порфирин является чувствительным к рН сенсибилизатором для лечения фотодинамической раковой опухоли.
Для того, чтобы ввести пути биосинтеза клеточного порфирина, фотосенсибилизаторы-предшественники должны быть эффективно интернализованы клетками-мишенями и обработаны в фотосенсибилизаторе PpIX. В этом общем контексте мы исследовали использование новых коротких полипептидных меченых ALA-пролекарств для улучшения усвоения и селективности клеток ALA. Поли (L-гистидин) был выбран из-за его интересных свойств; как известно, проявляется активность нарушения эндосомной мембраны, которая индуцируется механизмом «протонной губки» имидазольных групп.21,22 Целью настоящего исследования было сформулировать PpIX из p-L-His-образных 5-ALA-производных и измерять полученное поглощение, внутриклеточное распределение и эффективность PDT против клеток рака толстой кишки человека (HCT116) при различных условиях рН. Были синтезированы ALA, содержащие различные длины цепей p (L-His), и были исследованы их генерация и эффективность PpIX.
ALA, 3- -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) и йодид пропидия были приобретены у Sigma Chemical Company (Сент-Луис, Миссури). FITC-аннексин V был получен от Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Калифорния). N, N’-диметилформамид (ДМФ) перегоняли над натрием. 1, 4-диоксан очищали колоночной хроматографией на активированном Al2O3 для удаления примесей пероксида и затем дистиллировали. Все другие химические реагенты, такие как N-α-трет-бутилоксикарбонил-N-им-бензил-1-гистидин (Boc-L-His (Bn) -OH) и PCl5, были приобретены у Sigma и использованы без дальнейшей очистки. Материалы для культивирования клеток были приобретены у Invitrogen (Grand Island, NY).
Boc-His (Bn) -OH 2,5 г суспендировали в безводном 1,4-диоксане (10 мл), к которому добавляли раствор пентахлорида фосфора (1,8 г) в 1,4-диоксане (20 мл) с образованием N -карбоксиангидрида (NCA) при 25 ° С при перемешивании. В течение нескольких минут был получен прозрачный раствор и затем профильтрован через стеклянный фильтр. Кристаллы 1-бензил-N-карбокси-L-гистидинового ангидрида были получены после добавления фильтрата к избытку диэтилового эфира. Затем продукт промывали и сушили в вакууме.
p (L-His) -осажденные производные ALA синтезировали путем полимеризации с раскрытием кольца ангидрида бензил-N-карбокси-L-гистидина, использующего аминогруппу ALA в качестве инициатора. Как правило, ALA (0,0655 г, 0,5 ммоль) и мономер ангидрида бензил-N-карбокси-L-гистидина (1,35 г, 5 ммоль) растворяли в ДМФА в двух отдельных колбах Шленка и затем объединяли с использованием переходной иглы в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали в течение трех дней при комнатной температуре в атмосфере темного инертного азота. После полимеризации растворитель концентрировали и раствор ДМФ осаждали в диэтиловом эфире и сушили в вакууме, получая ALA-p (Bn-L-His) n (n = 5, n = 10 или n = 15).
В круглодонную колбу загружали раствор ALA-p (Bn-L-His) n в трифторуксусной кислоте (200 мг, 3 мл). Затем добавляли четырехкратный молярный избыток 33 мас.% Раствора HBr в уксусной кислоте и реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при 0 ° С. Наконец, реакционную смесь осаждали в безводном диэтиловом эфире и продукт затем сушили в вакууме, получая ALA-p (L-His) n в виде желтого порошка (n = 5, n = 10 или n = 15).
Спектры 1H-ядерного магнитного резонанса (ЯМР) регистрировали на спектрометре Varian Unity Plus-400. Спектроскопический анализ на ультрафиолетовом излучении проводили на ПК Shimadzu UV-1650, а инфракрасные спектры Фурье-преобразования регистрировали на спектрометре Shimadzu IR Prestige 21 при комнатной температуре. Спектры были взяты на дисках KBr в диапазоне 3500-500 см-1.
Индекс молекулярной массы и полидисперсности продуктов определяли методом гель-проникающей хроматографии с использованием двух столбцов Styragel (HT3 и HT4, Waters Company) при 40 ° C. ДМФ, содержащий 0,1 N LiBr, использовали в качестве растворителя-носителя при скорости потока 1,0 мл / мин. Использовали насос Waters 1515 и детектор дифференциального показателя преломления Waters 2414. Монодисперсные полистирольные полимеры использовались в качестве калибровочных стандартов.
Клетки человеческой эмбриональной почки (HEK293T) и колоректальной карциномы (HCT116) культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (Invitrogen) и 1% антибиотиками при 37 ° C в 5% CO2 , Клетки были субкультивированы два раза в неделю.
Клетки HEK293T высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2 × 104 клеток на лунку и инкубировали в течение 24 часов при 5% СО2 при 37 ° С. Для теста на цитотоксичность клетки затем инкубировали в бессывороточной среде RPMI в течение 24 часов. После удаления культуральной среды лунки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором. Затем каждую лунку заменяли 100 мкл свежей среды RPMI, содержащей 0,1-1,0 мМ ALA или ALA-p (L-His), и клетки инкубировали в темноте при 37 ° C в течение 4 часов. После этого клетки промывали забуференным фосфатом солевым раствором три раза и оценивали цитотоксичность с использованием теста МТТ, как описано ниже.
Клетки HCT116 (2 × 104) высевали в 96-луночные планшеты и обрабатывали 1 мМ ALA или ALA-p (L-His) в бессывороточной среде в течение 4 часов. После этого среду заменяли на среду для выращивания, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки без облучения и инкубировали. Через 24 часа клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором дважды, и жизнеспособность клеток измеряли с помощью МТТ-анализа.
Клетки HCT116 высевали в 96-луночные планшеты, культивировали в течение 24 часов и затем промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором. После этого в каждую лунку добавляли 100 мкл бессывороточной среды, содержащей 1 мМ ALA или ALA-p (L-His), и клетки инкубировали в течение 4 часов. Контрольные лунки обрабатывали бессывороточной средой в отсутствие как ALA, так и ALA-p (L-His). Затем планшеты подвергали воздействию расширенного гомогенного пучка с длиной волны 635 нм в дозе 1,0 Дж / см2, измеренной фоторадиометром. Сразу же после облучения среду удаляли и клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором. После этого добавляли 100 мкл свежего RPMI с 10% забуференным фосфатом физиологическим раствором и клетки инкубировали еще в течение 24 часов. Фототоксичность клеток определяли методом МТТ, как описано ниже.
Влияние PDT на пролиферацию клеток измеряли с использованием модифицированного теста MTT. Анализ МТТ основан на том факте, что живые клетки, содержащие активные митохондрии, способны расщеплять кольцо тетразолия на молекулу, которая поглощает свет при 570 нм. Клетки культивировали в 96-луночных планшетах с плотностью 2 × 104. После удаления культуральной среды к каждой добавке добавляли 100 мкл свежей среды, содержащей 25 мкл МТТ-реагента (2 мг / мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе, Sigma) Что ж. Клетки дополнительно инкубировали при 37 ° С в течение 3 часов. Затем клетки лизировали 100 мкл раствора лизирующего буфера (10% додецилсульфата натрия в 0,01 н. HCl) в течение 18 часов и измеряли оптическую плотность при 570 нм.
Продукты PpIX наблюдались с использованием флуоресцентного микроскопа. Микроскоп был оснащен фильтром возбуждения 460-480 нм и фильтром излучения 610 нм для обнаружения флуоресценции PpIX. Клетки размером 1 × 106 HCT116 высевали на покрытие в каждой лунке 6-луночного планшета. Затем клетки обрабатывали 1,0 мМ ALA или ALA-p (L-His) в течение 4 часов в бессывороточной среде, после чего среду отбрасывали. Затем клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором, фиксировали 4% параформальдегидом в забуференном фосфатом физиологическом растворе, смонтировали на стеклянном слайде и наблюдали с использованием флуоресцентного микроскопа.
Для подтверждения гибели клеток, вызванной PDT, было исследовано по меньшей мере 10 000 закрытых клеток с использованием проточного цитометра FACScan (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA). Для идентификации апоптоза и некроза клеток HCT116 использовали два реагента, FITC-аннексин V и йодид пропидия. Клетки обрабатывали 1 мМ ALA или ALA-p (L-His) при рН 6,8 или 7,4 в течение 4 часов. После этого клетки облучали при 635 нм 1 Дж / см2 и собранные клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором. Контрольная ячейка не лечилась каким-либо лекарством или светом. Гранулы ресуспендировали с помощью связывающего буфера (10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновой кислоты , рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1,8 мМ CaCl2), содержащего FITC-аннеин V 1 мкг / мл и дополнительно инкубировали в течение 30 минут. За десять минут до прекращения инкубации йодид пропидия 10 мкг / мл добавляли для окрашивания некротических клеток в темных условиях. После этого клетки немедленно анализировали с использованием проточного цитометра FACScan.
Результаты выражаются как средства, по крайней мере, параллельных экспериментов ± стандартное отклонение. Статистический анализ данных проводился с использованием t-теста Стьюдента, при этом Р
Теория функциональных функций плотности и вычисления индексов Fukui были выполнены с использованием программы DMol3, реализованной в программном обеспечении версии 4.6.1.23 для Материалов Studio, высококачественной компьютерной программы квантовой механики (Accelrys, San Diego, CA). Мы оптимизировали геометрию ALA, ALA-p (His) 5, ALA-p (His) 10 и ALA-p (His) 15 в водной фазе. Водная фаза была представлена проводящей моделью экранирования (Cosmo) .24,25 Мы вычислили энергии и геометрии соединений, используя приближение локальной плотности Воско-Вилк-Назаира.26 Затем энергии были уточнены одноточечной энергией вычислений с использованием обобщенного градиентного приближения (PW91) Пердью и Ванга.27. Вычисления для всех моделей выполнялись с использованием базисного набора с двойной численной плюс-поляризацией.28
Исходным этапом в ALA-индуцированном синтезе порфиринов является проникновение ALA через плазматическую мембрану. ALA является гидрофильной молекулой, и ее гидрофильность может быть клиническим ограничением для использования ALA в PDT из-за низкой скорости поглощения гидрофильного препарата в клетках и / или плохого проникновения таких препаратов через ткань. 29,30 Первоначально это проблема частично была решена путем синтеза пролекарств липофильного эфира, которые обеспечивают улучшенное поглощение клеток и метаболизируются в PpIX после действия неспецифических внутриклеточных эстераз. Более поздняя разработка касается получения пролекарств ALA на основе пептида.16-19,31. Этот подход описывает синтез и оценку коротких производных пептида ALA, в которых либо амино, либо карбоксильная функция последнего маскируется, тем самым обеспечивая улучшенные физические свойства и потенциал для выделения клеточной линии ALA.
Среди них поли (L-His) является отличным кандидатом из-за его способности придать липофильность и растворимость воды в пролекарствах. Физиологически значимый диапазон рН составляет 5,0-7,4; пролекарства, в которых протонирование происходит в этом диапазоне рН, пригодны для изготовления рН-чувствительных лекарств для интернализации клеточного уровня. Важно отметить, что фузогенная активность p (L-His) может нарушить оболочку мембраны кислых субклеточных отделений, таких как эндосомы, тем самым повышая эффективность доставки лекарственного средства / нуклеиновых кислот в цитозоль.32
Хорошо известно, что первичная аминогруппа или аминогруппа гидрохлорида может инициировать полимеризацию N-карбоксиангидрида альфа-аминокислоты.33 В этом исследовании, в качестве альтернативного подхода, мы использовали функциональные функции аминов гидрохлорида АЛК для синтеза модифицированных пролекарств. Синтезированные pH-чувствительные ALA-p (L-His) пролекарства более липофильные, чем ALA, но все еще водорастворимые. Процедура синтеза пролекарств показана на рисунке 1.
Защитные бензильные боковые цепи удаляли обработкой ALA-p (Bn-His) n HBr / AcOH в трифторуксусной кислоте и полученный продукт характеризовали гель-проникающей хроматографией и различными спектроскопическими методами. Спектры ЯМР ЯМР ALA-p (L-His) показаны на рисунке 2.
В дополнительных данных показаны графики гель-проникающей хроматографии, а также ультрафиолетовые и инфракрасные спектры с преобразованием Фурье (см. Рисунки S1-S3). Молекулярная масса ALA-p (L-His), измеренная с помощью гель-проникающей хроматографии, демонстрирует небольшую переоценку молекулярной массы, хотя молекулярная масса, рассчитанная по 1H-ЯМР, согласуется с теоретическим значением. После снятия защиты для расчета Mn использовали пиковое интегральное отношение метиленового протона ALA (δ = 3,8 ppm) и (O = C-CH-) в блоке пептида (δ = 4,95 ppm), что подтвердило отсутствие потерь повторяющихся звеньев гистидина во время снятия защиты. Поэтому мы можем убедиться, что полимеризация Bn-His-NCA и снятие защиты с бензильных групп были успешно выполнены с использованием ALA в качестве инициатора.
Реакционная способность соединения, как полагают, тесно связана с его пограничными молекулярными орбиталями, то есть с наивысшей занятой молекулярной орбиталью (HOMO) и самой низкой незанятой молекулярной орбиталью (LUMO). Высшая энергия HOMO (EHOMO) молекулы означает более высокую способность донора электронов к соответствующим акцепторным молекулам с низкоэнергетической пустой молекулярной орбиталью и, таким образом, объясняет взаимодействие между молекулами посредством делокализованных пар электронов. Энергия LUMO (ELUMO) стандартизирует электроноакцепторную тенденцию молекулы. Соответственно, ELUMO, EHOMO, электронный заряд на атомах азота и кислорода и полная энергия молекулы (ET) определялись и сравнивались. Глобальную твердость (η) можно было бы также оценить из зазора HOMO-LUMO, поскольку она аппроксимирована как ΔE / 2,34 и может быть определена по принципу химической твердости и мягкости.35 Эти параметры также предоставляют информацию об реактивном поведении молекул и показаны в таблице 1.
Поскольку экзогенное ALA-опосредованное накопление PpIX происходит в водной фазе, необходимо включить эффект воды в расчетные расчеты. Аналогичным образом важно учитывать эффекты, которые могут проявляться как в геометрических свойствах, так и в электрических. Dmol3 включает в себя некоторые элементы управления COSMO36, которые позволяют использовать эффекты сольватации. COSMO является моделью континуальной сольватации, в которой растворенная молекула образует полость внутри диэлектрического континуума диэлектрической проницаемости, а ɛ представляет собой растворитель. Молекулы растворителя моделируются как непрерывная однородная диэлектрическая постоянная (ɛ = 78,39 для воды), а растворенное вещество помещается в полость внутри него.34 Поверхность полости (или поверхность, доступная растворителю) получается как наложение сфер, центрированных на атомов, отбрасывая все части, лежащие на внутренней части поверхности.24 Сферы представлены дискретным множеством точек, т. е. так называемыми базисными точками. Исключение частей сфер, которые лежат внутри внутренней части молекулы, таким образом, сводится к устранению основных точек сетки, которые лежат внутри молекулы. Радиусы сфер определяются как сумма радиусов Ван-дер-Ваальса атомов молекулы и радиуса зонда. Затем оставшиеся основные точки сетки масштабируются, чтобы лежать на поверхности, порожденной сферами радиусов Ван-дер-Ваальса. Затем основные точки собираются в сегменты, которые также представлены в виде дискретных точек на поверхности. Расходы на скрининг расположены в точках сегмента. Результаты для доступных для растворителя поверхностных, тотальных и сольватирующих энергий, орбитальных энергий HOMO и LUMO, ΔE и η, рассчитанных для ALA, ALA-p (His) 5, ALA-p (His) 10 и ALA-p (His) 15 в водной фазе, показаны в таблице 1. Оптимизированные геометрии, включая полость поверхности соединений, а также молекулярные орбитали HOMO и LUMO, показаны на рисунке 3.
Как и ожидалось, площадь поверхности и объем полости увеличиваются с увеличением размера молекулы от ALA до ALA-p (His) 15. Глобальная твердость — это параметр, который дает важную информацию об реактивном поведении молекулы. Молекула ALA показывает максимальное значение твердости и уменьшается по порядку ALA-p (His) 10> ALA-p (His) 5> ALA-p (His) 15. Молекула ALA имеет самый высокий EHOMO и самый низкий ELUMO, что объясняет более высокую тенденцию молекулы к пожертвованию электронов, а также прием электронов из соседних молекул воды. Эти значения могут значительно изменяться путем конъюгирования p (His) единиц с молекулой ALA. Кроме того, HOMO перемещается от атома азота молекулы ALA к атомам азота гистидиновых колец в молекулах ALA-p (His) n. Это указывает на то, что предпочтительные активные сайты для электрофильной атаки расположены в области вокруг атомов азота, принадлежащих гистидиновым кольцам, до того, как p (His) единицы диссоциируют из ALA-p (His) конъюгатов. Эти различия в ΔE и положениях HOMO и LUMO приводят к широким колебаниям растворимости в воде, особенно в разных условиях pH, и с индуцированным светом накоплением PpIX. Энергия сольватации, т. Е. Изменение энергии Гиббса при переносе молекулы из вакуума в растворитель, резко уменьшается после того, как p (His) единицы конъюгированы с молекулой ALA. Учитывая, что основной вклад в энергию сольватации приходится на энергию кавитации образования дырки, которая сохраняет растворенные частицы в растворителе, энергию ориентации частичной ориентации диполей, энергию изотропного взаимодействия электростатического и дисперсионного происхождения и анизотропной энергии специфических взаимодействий, например водородных связей и донорно-акцепторных взаимодействий, ожидается, что молекула ALA проявит совсем другое поведение в воде из молекул ALA-p (His).
Среди теоретических моделей, предлагаемых для расчета локальных индексов реактивности, есть функции Фукуи, которые позволяют рационализировать реактивность отдельных вкладов молекулярных орбиталей и, следовательно, учитывать реакцию всего молекулярного спектра, а не только пограничных орбиталей. Несколько эталонных применений этого протокола, описывающих селективность и реактивность с помощью орбитальных индексов Фукуи, были представлены Миневой и др. 37. С целью более широкого ознакомления с локальной реакционной способностью ALA и ALA-p (His) гибридов, Вычислены индексы Фукуи для каждого из атомов в молекулах. Анализ индексов Фукуи наряду с распределением зарядов и глобальной твердостью дает более полную схему реакционной способности исследуемых молекул.38 Индексы Фукуи, рассчитанные для всех нейтральных атомов ALA и каждого из трех ALA-p (His) показаны на рис. 2. Было показано, что локальные плотности электронов или заряды важны во многих химических реакциях и физико-химических свойствах соединения.39 Плоские орбитальные плотности электронов на атомах являются полезным средством для детальной характеристики донорно-акцепторных взаимодействий, Для конечных систем, таких как ALA и ALA-p (His) гибридные молекулы, когда молекула принимает электроны, имеется заряд Фукуи плюс (fk +), т. Е. Индекс нуклеофильной атаки; когда молекула является донором электронов, у нее есть заряд минус Fukui (fk +), т. е. индекс электрофильной атаки. Анализ индексов Фукуи показывает, что для гибридных молекул ALA-His атомы азота в гистидиновом кольце являются более восприимчивыми местами для электрофильной атаки, чем атомы ALA. Значение fk + было почти незначительным для всех молекул, что указывает на нечувствительность к нуклеофильной атаке.
Чтобы исследовать влияние ALA-p (L-His) в качестве альтернативы ALA для PDT, клетки рака толстой кишки HCT116 использовали в качестве модельной линии клеток рака. Чтобы подтвердить, был ли эффект гибели клеток вызван только фотоиндуцированной цитотоксичностью, цитотоксичность и темную токсичность ALA и синтезированных производных ALA-p (L-His) проводили при рН 7,4 и 6,8 в клетках HEK293T и HCT116 в отсутствие легкий. Как показано на рисунке 4, жизнеспособность клеток HEK293T и HCT116 в присутствии 1 мМ ALA или ALA-p (L-His) производных была относительно выше 100%; сами пролекарства не влияли на выживание клеток. Этот результат указывает на то, что действие PDT на основе ALA и ALA-p (L-His) на клетки HCT116 зависит от производства PpIX от пролекарств в опухолевых клетках, а не от самих пролекарств. Это ясно показывает, что производные ALA и ALA-p (L-His) способствуют пролиферации клеток и не влияют на выживаемость клеток в отсутствие облучения при концентрациях ниже 1 мМ.
Влияние PDT на основе ALA-p (L-His) оценивали обработкой клеток HCT116 концентрацией 1 мМ пролекарства в течение 4 часов в темноте. После облучения процент выживаемости клеток по сравнению с контрольными клетками оценивали с использованием теста МТТ. Из рисунка 5 видно, что ALA-p (L-His) n обладает высокой фототоксичностью по сравнению с ALA. Поскольку длина цепи гистидина возрастает в пролекарствах ALA-p (L-His) n, эффект ФДТ оказался более мощным. В частности, высокая фототоксичность наблюдалась, когда клетки обрабатывали ALA-p (L-His) 15 по сравнению с лечением с использованием только ALA. Кроме того, фототоксичность была выше, когда клетки инкубировали с ALA-p (L-His) 10 и ALA-p (L-His) 15 при более низком рН, чем при физиологическом рН 7,4. Имидазольное кольцо (pKb около 6,5) p (L-His) имеет одиночные пары электронов, которые придают ему рН-зависимые амфотерные свойства. Протонность наблюдалась как раз ниже физиологического рН, что указывает на то, что блок гистидина, присоединенный к пролекарствам ALA-p (L-His) n, может действовать как протон-рецептор и, следовательно, влиять на интернализацию в опухолевые клетки. Обе заряженные и незаряженные формы гистидина присутствуют в p (His) при нейтральном рН, а отношение концентрации заряженной формы к незаряженной форме очень чувствительно к небольшим изменениям рН в физиологических условиях.40 Кроме того, ионизация р (L-His) переключает природу материала на более липофильную, а p (L-His) демонстрирует сильные эндосомолитические свойства благодаря его протонному губчатому эффекту и / или его взаимодействию с анионными фосфолипидами, содержащими эндосомальные компартменты.22
Низкое значение рН в интерстициальной жидкости в большинстве опухолей, безусловно, играет значительную роль, поскольку многие локализующие опухоль фотосенсибилизаторы протонируют, становятся более липофильными и быстрее накапливаются в клетках при понижении рН инкубационной среды. Применение ALA или ALA-p (L-His) n приводит к накоплению фотосенсибилизатора PpIX в опухолях. Низкие уровни феррохелатазной активности и высокий уровень активности порфиллиногендеаминазы были обнаружены в злокачественных клетках и тканях, 41-43, что может способствовать наблюдаемой избирательности опухоли PpIX.44,45
Как описано выше, скорость эндоцитоза ALA-p (L-His) -производных в опухолевых клетках первоначально увеличивается при кислом рН, и ожидается, что различия в фототоксичности при разных условиях рН обусловлены эффектом протонной губки p (L-His) и является следствием зависимости рН от порфибилиногендезаминазы в злокачественных клетках и тканях. Это явление было четко отмечено для всех пролекарств и было сильнее с увеличением длины гистидиновой метки.
Накопление PpIX в клетках HCT116, индуцированное 4-часовой обработкой 1 мМ каждого из ALA и ALA-p (L-His) 15, наблюдалось с помощью флуоресцентной микроскопии. Как показано на фиг.6, красная флуоресценция наблюдалась в клетках, обработанных пролекарствами ALA-p (L-His) n, тогда как в контрольных и контрольных группах ALA наблюдался небольшой или отсутствующий сигнал флуоресценции. Эти результаты показывают, что вводимые пролекарства были успешно преобразованы в PpIX в клетках HCT116. Мы обнаружили, что p (L-His) сама по себе имеет флуоресценцию до некоторой степени, поэтому трудно узнать точное количество внутриклеточного PpIX на выходе (данные не показаны). Однако, сравнивая изображение флуоресценции, как темная токсичность и фототоксичность, ясно, что синтезированные пролекарства ALA-p (L-His) n не имеют никакой цитотоксичности или темной токсичности в нормальных клетках или линиях раковых клеток. Поэтому феномен смерти в раковых клетках наблюдался только после облучения при 1,0 Дж / см2 света. Кроме того, из изображений флуоресценции мы обнаружили, что интенсивность флуоресценции стала сильнее при более низких условиях pH с помощью ALA-p (L-His) n пролекарств. Этот результат коррелирует с данными фототоксичности от синтезированных пролекарств, т.е. выживаемость клеток ниже в физиологическом состоянии при более низком уровне рН. Флуоресцентные изображения клеток, обработанных пролекарствами ALA-p (L-His) n или ALA в течение 4 часов, показали, что пролекарства ALA-p (L-His) n являются потенциально сильными фотосенсибилизаторами, зависящими от условий окружающей среды культуры, рН 6,8 или рН 7,4.
После ALA или ALA-p (L-His) n-основанного PDT опухолевые клетки окрашивали FITC-аннексином V и пропидиум-иодидом для визуализации апоптотических клеток (фиг. 7A) и некротических клеток (фиг. 7B) соответственно. Как показано на рисунке 7, количество апоптотических клеток постепенно увеличивалось при кислом рН и с ALA-p (L-His) 15. Кроме того, количество некротических клеток также резко возрастало в соответствии с культуральной средой или пролекарством, а некроз опухолевых клеток доминировал над апоптозом.
По оценкам, доля апоптотических клеток составляла около 5,1%, когда их лечили только ALA. Такое же явление наблюдалось в некротических клетках (около 13%). Соотношения апоптотических и некротических клеток в обработанных ALA группах показывают сходные популяции независимо от рН культуры. В PDT на основе ALA фототоксичность была вызвана апоптозом или некрозом, а pH окружающей среды не влиял на сигналы гибели клеток. В недавно синтезированных пролекарственных группах наблюдалось явное явление. Соотношение апоптотических и некротических клеток увеличилось с 12% до 19% и от 38% до 45% соответственно при лечении ALA-p (L-His) 15 при рН 6,8. Эти результаты показывают, что ФДТ, основанный как на ALA, так и на ALA-p (L-His) n, индуцировал гибель клеток HCT116 через апоптоз и некроз и, кроме того, вызванную рН-клеточной гибелью во время ALA-p (L-His) n-based PDT.
Мы предлагаем новую систему с легким синтетическим подходом, включающим использование тегов p (His) на ALA для улучшения селективности PDT при лечении рака. Пролекарства ALA на основе P (His) не проявляли цитотоксичности при введении в клетки HCT116 в течение 4 часов. Пролекарство проявляло фототоксичность, даже если вводилось в течение короткого времени (4 часа), и это явление было значительно выше в группе, получавшей ALA-p (L-His) 15, чем в контрольной группе. Считается, что повышенная фототоксичность этих пролекарств при различных условиях рН обусловлена эффектом протонной губки p-L-His-остатков и является следствием высокой активности порфибилиногендезаминазы в злокачественных клетках и тканях при условиях рН найденных в культуре. Недавно синтезированные производные ALA-p (L-His) n считаются эффективной альтернативой ALA для усиления продукции PpIX и селективности фототоксического эффекта в опухолевых клетках.
Новые пролекарства 5-аминолевулиновой кислоты с меченым поли (L-гистидином): новые фотосенсибилизирующие предшественники протопорфирина IX для фотодинамической терапии рака толстой кишки.
13C ядерно-магнитного резонансного спектра ALA-p (His) 15 в диметил-d6-сульфоксиде при 25 ° C.
Пробы гель-проникающей хроматографии (A) ALA-p (His) 5, (B) ALA-p (His) 10 и (C) ALA-p (His) 15.
Примечание. Наблюдается заметное увеличение молекулярного веса и монодисперсности.
Аббревиатура: ALA, 5-аминолевулиновая кислота.
Ультрафиолетово-видимые спектры ALA (λmax 267 нм) и ALA-p (His) производных показывают два максимума поглощения (λmax 267 нм и 336 нм).
Аббревиатура: ALA, 5-аминолевулиновая кислота.
Инфракрасные спектры Фурье-преобразования производных ALA-p (His) показывают характерное растяжение связей.
Аббревиатура: ALA, 5-аминолевулиновая кислота.
Эта работа была поддержана грантами в рамках программы Университета мирового класса (R32-2008-000-10174-0), Национальной программы Центра фундаментальных исследований от MEST (R15-2006-022-01001-0) и грант от Проекта R & D в области здравоохранения в области здравоохранения Министерства здравоохранения и по делам семьи Республики Корея (A091047).
Процедуры синтеза ALA-p (His) путем полимеризации с открытием кольца Bn-His-NCA с последующим снятием защиты: (A) PCl5, 1,4-диоксан; (B) N, N’-диметилформамид; и (C) HBr / AcOH, TFA при 0 ° C.
1H спектры ядерного магнитного резонанса ALA-p (His) 15 в сульфоксиде диметил-d6 при 25 ° C.
Аббревиатура: ALA, 5-аминолевулиновая кислота.
Геометрически оптимизированная структура ALA и ALA-p (His) n, молекулярных орбитальных участков, а также активные сайты Фукуи для электрофильной и нуклеофильной атаки на молекулы ALA и ALA-p (His) n.
Примечание. В водной фазе были проведены расчеты плотности функционала и вычисления индексов Фукуи.
(A) Цитотоксичность ALA и ALA-p (L-His) пролекарств в клетках HEK293T. После 24 часов голодания клетки обрабатывали 0,1-1,0 мМ каждого пролекарства ALA в течение 4 часов. Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ. (B) Клеточная темная токсичность ALA и ALA-p (L-His) пролекарств при концентрации 1 мМ в клетках HCT116 при рН 6,8 и 7,4. После культивирования в 96-луночном планшете клетки обрабатывали 1,0 мМ каждого пролекарства ALA в течение 4 часов. Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ.
Фотодинамический эффект пролекарств ALA и ALA-p (L-His) (концентрация 1 мМ) на клетках HCT116 при рН 7,4 и 6,8. 100 мкл бессывороточной среды, содержащей 1,0 мМ пролекарств, добавляли к клеткам HCT116 после инкубации в течение 4 часов.
Примечания: Контроль обрабатывали бессывороточной средой в отсутствие как ALA, так и p (L-His) -ALA. После облучения в дозе 1,0 Дж / см2 среду удаляли и промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором. Затем добавляли свежий 100 мкл RPMI с 10% забуференным фосфатом физиологическим раствором и клетки инкубировали еще в течение 24 часов. Клеточная фототоксичность определяли методом МТТ.
Сокращения: ALA, 5-аминолевулиновая кислота; p (L-His), поли (L-гистидин).
Флуоресцентные микроскопические изображения накопления протопорфирина IX из пролекарств ALA и ALA-поли (L-гистидина) в клетках HCT116 при рН 7,4 (A-D) и при рН 6,8 (A1-A4). Клетки HCT116 обрабатывали 1,0 мМ ALA или поли (L-гистидином) -ALA в течение 4 часов в бессывороточной среде.
Примечание. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом в забуференном фосфатом физиологическом растворе, и клетки наблюдали с использованием флуоресцентного микроскопа.
Аббревиатура: ALA, 5-аминолевулиновая кислота.
Апоптоз и некроз, индуцированные АЛК или ALA-p (L-His) 15 фотодинамической терапией в клетках HCT116 при рН 7,4 и 6,8. После пролекарств или без обработки в течение 4 часов клетки HCT освещались при 635 нм. Клетки окрашивали FITC-аннексином V (A) и иодидом пропидия (B), затем анализировали с использованием проточного цитометра.
Примечание. Число в каждом квадрате — это процент клеток в области P2 или P3 общей совокупности.
Сокращения: ALA, 5-аминолевулиновая кислота; p (L-His), поли (L-гистидин).
Молекулярные свойства молекул ALA и ALA-p (His) n, рассчитанные с использованием метода теории функционала плотности в водной фазе
Сокращения: ALA, 5-аминолевулиновая кислота; HOMO, наивысшая занятая молекулярная орбиталь; LUMO, самая низкая занятая молекулярная орбиталь.
Аминолевулиновая кислота – это органическое вещество, которое образуется в результате синтеза таких компонентов как тетрапирролы – порфирины, под действием особого пиридоксальфосфатзависимого фермента.
Какое у вещества Аминолевулиновая кислота действие?
Фотосенсибилизирующее средство Аминолевулиновая кислота является усилителем синтеза особого эндогенного фотосенсибилизатора, который называется протопорфирин IX. Механизм действия этого вещества основан на том, что опухолевые клетки могут накапливать фотоактивный протопорфирин IX.
Непосредственно накопление протопорфирина IX в опухолевых тканях мочевого пузыря осуществляется на протяжении полутора или же двух часов после проведенного внутрипузырного введения препарата.
Контрастирование опухолевых участков и окружающей ткани можно регистрировать уже на протяжении первого часа после окончания введения средства, что позволяет уточнять границы злокачественного образования при проведении флюоресцентной диагностики.
Кроме этого можно выявлять не очень хорошо определяемые опухолевые образования, что позволит в последующем провести органосохраняющее лечение без повреждения здоровой ткани, которая непосредственно окружает опухоль.
В течение двух суток после проведения внутрипузырного введения препарата, содержащего Аминолевулиновую кислоту, у подавляющего числа пациентов не повышается концентрация протопорфирина IX в крови и в моче.
Аминолевулиновая кислота накапливает фотоактивные порфирины непосредственно в тканях новообразований, особенно это касается клеток злокачественной глиомы. Соответственно, данное соединение используется в онкологической практике для визуализации опухолевых тканей, а также при нейрохирургических вмешательствах.
Показания Аминолевулиновой кислоты к применению
Аминолевулиновая кислота применяется в онкологической практике когда проводится флуоресцентная диагностика опухоли мочевого пузыря, локализирующейся поверхностно. Это заболевание составляет примерно три процента от рака всех локализаций. Стоит отметить, что в группу риска входят те категории людей, кто подвержен довольно частому воздействию так называемых ароматических аминов, а также те лица, кто страдает хроническим циститом.
Прогноз рака мочевого пузыря будет зависеть от стадии заболевания, от наличия метастазов, а также от своевременно выполненного лечения. После проведения необходимого радикального оперативного вмешательства можно прогнозировать пятилетнюю выживаемость пациента примерно в пятидесяти процентах случаев.
Противопоказания Аминолевулиновой кислоты к применению
Среди противопоказаний можно отметить только одно состояние, когда использовать Аминолевулиновую кислоту нельзя, и это повышенная чувствительность организма к этому органическому веществу. Гиперчувствительность чаще проявляется у тех пациентов, в анамнезе которых в целом повышен аллергенный фон.
Применение Аминолевулиновой кислоты и дозировка
Аминолевулиновая кислота применяется внутрипузырно, ее рекомендуется вводить в дозировке 1,5 г непосредственно в полость мочевого пузыря с помощью катетера, где-то за два часа до начала флюоресцентной диагностики, а также и последующего лечения. Источником излучения, который стимулирует флюоресценцию протопорфирина IX в опухолевых тканях, служит оптическое излучение с длиной волны от 385 до 440 нм.
Какие у Аминолевулиновой кислоты побочные действия?
Среди побочных реакций на внутрипузырное введение этого препарата, можно отметить только аллергические реакции, которые встречаются достаточно редко. Они могут выражаться в виде дерматологических проявлений, в виде кожной сыпи, гиперемии и некоторой отечности, а также может присоединяется зуд кожных покровов.
Передозировка препарата Аминолевулиновая кислота
Каких-либо данных о передозировке средств, в состав которых входит Аминолевулиновая кислота, до настоящего времени пока не выявлено.
Препараты, содержащие Аминолевулиновую кислоту (аналоги)
5-Аминолевулиновой кислоты гидрохлорид, этот медикаментозный препарат производится в субстанции-порошке, эта лекарственная форма помещена в пачки или в пластиковые банки.
Еще один препарат, содержащий Аминолевулиновую кислоту, называется Аласенс, он выпускается в порошке, из которого готовят специальный раствор для внутриполостного введения. Применяют его для флюоресцентной диагностики опухолей мочевого пузыря, при этом такая процедура проводится только в медицинском учреждении.
Заключение
Препараты, содержащие Аминолевулоновую кислоту, должны применяться только в стационарных условиях для проведения диагностических мероприятий при раке мочевого пузыря.
Профилактика этого заболевания будет складываться из мероприятий, которые должны быть направлены на устранение контакта человека с химикатами, рекомендуется своевременно проводить диспансеризацию. При выявленных папиломах в мочевом пузыре, они должны быть подвергнуты радикальному лечению путем проведения электрокоагуляции, либо хирургическому иссечению. Кроме этого следует лечить цистит, и не доводить его до хронического течения.
Проведенные исследования выявили связь курения со злокачественным образованием в мочевом пузыре, соответственно, отказ от табакокурения должен быть необходимой профилактической мерой для предупреждения развития этого грозного заболевания.
Входит в состав препаратов
АТХ:V.04 Диагностические препараты
L.01 Противоопухолевые препараты
Фармакодинамика:Пролекарство, которое in situ превращается в протопорфирин IX, накапливающийся внутриклеточно в коже. Цитотоксический эффект при облучении светом с определенной длиной волны в присутствии кислорода обусловлен возбуждением молекул протопофирина, образованием активных радикалов кислорода из молекул кислорода с дальнейшим образованием супероксидных и гидроксильных радикалов
Фармакологические эффекты
Фотосенсибилизирующий. Эффект наступает через 6 ч после приема внутрь2, максимально через 11 ч.
Фармакокинетика:Пролекарство, in situ превращается в протопорфирин, затем в гем. Т1/2 - 0,7-0,83 ч ( при приеме внутрь или парентеральном введении), 30 ч (протопорфирин IX при нанесении на поврежденную кожу), 8 ч (протопорфирин IX при приеме внутрь).
Показания:Флюуоресцентная диагностика поверхностных опухолей мочевого пузыря3.
Флуоресцентная диагностика Ta/T1 переходно-клеточного рака мочевого пузыря с последующей резекцией мочевого пузыря: применение аминолевулиновой кислоты¤ в сравнении с обычной цистоскопией вызывает удлинение медианы длительности безрецидивного периода в случае множественных или рецидивных карцином. При первичных и одиночных карциномах удлинение безрецидивного периода статистически незначимоB4.
XXI.Z00-Z13.Z03 Медицинское наблюдение и оценка при подозрении на заболевание или патологическое состояние
Противопоказания:Гиперчувствительность, порфирия. С осторожностью - Нарушения свертывания крови.
С осторожностью:Нарушения свертывания крови.
Беременность и лактация:Беременность
Кормление грудью
Нет сведений о проникновении в грудное молоко, осложнения у человека не зарегистрированы.
Способ применения и дозы:Внутрипузырно вводят в дозе 1,5 г в виде 3% раствора. 50 мл раствора вводят через катетер в мочевой пузырь за 1,5-2 ч до проведения сеанса флюоресцентной диагностики и последующего лечения (электрорезекция и др.). Для приготовления раствора: 1,5 г препарата растворяют в 50 мл стерильного 5% раствора натрия гидрокарбоната непосредственно перед использованием. Диагностические исследования проводят через 1,5-2 ч после инстилляции раствора в мочевой пузырь. В качестве источника излучения, стимулирующего флюоресценцию протопорфирина IX в тканях, используют оптическое излучение с длиной волны в диапазоне 385-440 нм.
Применение у детей
Эффективность и безопасность не изучены.
Побочные эффекты:Кровотечения (2-4%).
Передозировка:При приеме внутрь - транзиторное повышение активности печеночных трансаминаз. Последствия передозировки при местном применении не установлены. Лечение симптоматическое. Следует избегать воздействия солнечного света в течение 40 ч.
Взаимодействие:Другие фотосенсибилизирующие лекарственные средства (тиазидные диуретики, фенотиазины, сульфаниламиды, производные сульфонилмочевины, тетрациклины, а также препараты зверобоя) - усиление фотосенсибилизации.
Особые указания:Эффективность фотодинамического повреждения сенсибилизированной клетки определяется внутриклеточной концентрацией (уровнем накопления) сенсибилизатора, его локализацией в клетке и фотохимической активностью (квантовым выходом генерации синглетного кислорода или свободных радикалов), подводимой световой дозой лазерного облучения и способом ее подведения. Кроме прямого цитотоксического воздействия на опухолевые клетки при ФДТ важную роль в деструкции атипичных клеток играют нарушение кровоснабжения за счет повреждения эндотелия кровеносных сосудов опухолевой ткани и цитокиновые реакции, обусловленные стимуляцией продукции ФНО-α, активацией макрофагов, лейкоцитов и лимфоцитов.
ФДТ, помимо кровотечений, может сопровождаться дизестезией (в месте аппликации): покраснением, зудом, ощущением покалывания, онемением, пощипыванием. Дизестезии тяжелой степени встречаются у 50% пациентов. При проведении ФДТ максимум выраженности дизестезий приходится на 6-ю минуту облучения (проявления стихают через различные промежутки времени - в зависимости от индивидуальных особенностей через 1 мин-24 ч - после прекращения облучения). Кроме того, возможны отечность, эрозии, гипо- и гиперпигментация кожи, волдыри, корки в области аппликации. После ФДТ могут развиваться покраснение, отек и пластинчатое шелушение окружающих тканей. Однако эти повреждения временные и полностью разрешаются спустя 4 нед после лечения.
В США и Великобритании применяют для лечения сенильных кератозов (негиперкератотических) методом ФДТ.
Инструкции
